很多時(shí)候，我們需要把細(xì)胞冷凍起來(lái)，以便于長(zhǎng)期保存，以備不時(shí)之需。而復(fù)蘇，就是使冷凍的細(xì)胞蘇醒過(guò)來(lái)，恢復(fù)活力。液氮罐廠(chǎng)家

其實(shí)，細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的protocol教科書(shū)和實(shí)驗(yàn)手冊(cè)上面都有。毛博我不想再重復(fù)了。這里，毛博根據(jù)自己做細(xì)胞培養(yǎng)近10年的經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)，談?wù)剳?yīng)該注意的一些事項(xiàng)和技巧，大部分都是血淚教訓(xùn)和經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。都是干貨喲。

1冷凍越慢越好，復(fù)蘇越快越好

高大上的實(shí)驗(yàn)室可以使用程序冷凍儀。一切由機(jī)器代勞。屌絲實(shí)驗(yàn)室就只好用人肉程序冷凍儀。具體的protocol，到處都有。毛博想提醒大家的是，細(xì)胞冷凍越慢越好，寧慢勿快。做細(xì)胞冷凍前，事先留出充足的時(shí)間。

而復(fù)蘇速度越快越好。從液氮罐里取出來(lái)之后，迅速放在37°C水浴中，然后使勁搖呀搖。令其盡快融化。

2高高興興上班，平平安安回家

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)里面最容易出事的部分。凡是和液氮接觸的操作，注意戴保護(hù)眼鏡和手套。最需要小心的是：復(fù)蘇的時(shí)候，在水浴中搖呀搖的時(shí)候。有時(shí)候小瓶會(huì)爆炸的。所以，一定要戴保護(hù)眼鏡和手套。不多說(shuō)了，說(shuō)多了滿(mǎn)眼都是淚。還有，凍存液中的DMSO是有毒致癌的。接觸的時(shí)候一定一定要帶好手套。

3凍存細(xì)胞數(shù)量要足夠

無(wú)論再怎么小心，細(xì)胞在冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中總會(huì)死掉一批的。所以，一開(kāi)始凍存細(xì)胞的數(shù)量要足夠。一般最低要達(dá)到5×106/毫升，一瓶不夠兩瓶湊。但是，這個(gè)不能一概而論。有些細(xì)胞，比如雜交瘤細(xì)胞，只需要1-3x106/毫升。液氮罐廠(chǎng)家

4做好標(biāo)記

把培養(yǎng)瓶放入提手，末端應(yīng)該扎有小牌，注明主人的名字，細(xì)胞名稱(chēng)和凍存日期。還要在每個(gè)凍存管上寫(xiě)上細(xì)胞名稱(chēng)，代數(shù)和凍存日期。

實(shí)驗(yàn)室的液氮罐都是公用的。每個(gè)人應(yīng)該有屬于自己的提手。毛博當(dāng)年就發(fā)生過(guò)為了找自己的細(xì)胞，被迫把整個(gè)液氮罐翻了個(gè)底朝天的慘劇。

 

5細(xì)心呵護(hù)

剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞就象剛剛出生的baby，非常脆弱。需要我們的細(xì)心呵護(hù)。培養(yǎng)液要事先在培養(yǎng)箱或者水浴中復(fù)溫。一切的和細(xì)胞接觸的動(dòng)作都要輕柔。把細(xì)胞從凍存管里吸出來(lái)，注入離心管，要輕輕地吸取和滴加。包括給離心管補(bǔ)加培養(yǎng)液的時(shí)候，都要輕輕地滴加。離心要用低速離心(500-1000轉(zhuǎn)/分鐘)。吹打要用專(zhuān)用的吹打管，而不要圖方便用移液槍?zhuān)荡蛞惨p輕的。

6DMSO的問(wèn)題

上面提到了DMSO是一種有毒致癌物質(zhì)。那么，解凍之后，應(yīng)不應(yīng)該去除凍存液中的DMSO呢?答案是no。除了極少數(shù)特別注明的對(duì)DMSO敏感的細(xì)胞外，99%的細(xì)胞都不需要去除DMSO。解凍后的頻繁換液會(huì)慢慢去除掉DMSO的。液氮罐廠(chǎng)家

7物離鄉(xiāng)貴，人離鄉(xiāng)賤

解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清。因?yàn)槊恳环N細(xì)胞都有自己特定的，并且已經(jīng)熟悉了的生長(zhǎng)環(huán)境。突然使用不一樣的培養(yǎng)液和血清，會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)不良，甚至死亡。這和一個(gè)人突然離家千里，會(huì)水土不服是一樣的道理。

細(xì)胞培養(yǎng)是個(gè)苦活，根本離不開(kāi)人。毛博還記得當(dāng)年當(dāng)實(shí)驗(yàn)狗的時(shí)候，放個(gè)長(zhǎng)假都要惦記著培養(yǎng)箱里面的細(xì)胞是不是該換液了。而掌握了有效的凍存和復(fù)蘇的技術(shù)，就可以解決這個(gè)問(wèn)題。春節(jié)回家前把細(xì)胞都凍上，過(guò)了年回來(lái)再開(kāi)干。